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“你们的研究成果好像有那么点作用!这些研究成果可以抵扣你们的罪孽了!以后把重点放在研究上!你们需要什么东西,找我!包括天材地宝!”
三位白须老者脸色一下子舒展了!这是看到了活下去的希望!
本研究通过表征矮牵牛三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运体PhABCG1功能,证明挥发物通过质膜依赖于主动转运。通过RNAi下调PhABCG1导致挥发物排放减少,挥发物在质膜中也会积累到毒性水平。转运体可以调节其他植物和其他生物体内挥发性有机化合物的排放,这项研究提供了生物学介导挥发性物质排放的直接证据。
研究结果
1.矮牵牛花RNA-seq结果分析:获取得到高表达基因PhABCG1
以矮牵牛(Petuniahybrida)的花为研究对象,研究其挥发性苯和苯丙物质是否依赖于蛋白质介导的出口。由于某些非挥发性疏水性化合物,如蜡和二萜,通过三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运体通过质膜输出,作者搜索了牵牛花花瓣RNA测序(RNA-seq)数据集,以获取ABC转运体转录序列。在矮牵牛花中发现了一个高表达的候选基因,在第1天(花蕾期)和开放后第2天(花期)之间上调了103倍,这两个发育阶段分别是VOC排放量最低和最高的。该基因编码矮牵牛ABC亚家族G成员1PhABCG1,这是一种预测的功能未知的质膜转运蛋白,几乎只在开放花的花瓣中表达,并受ODORANT1转录因子调控,该转录因子控制矮牵牛花中VOC的生物合成。
2.PhABCG1参与VOC运输初步验证:PhABCG1RNA干扰系中VOC排放减少,细胞内部VOC增加
为了确定PhABCG1是否参与VOC的释放,作者在花瓣特异性芳樟醇合成酶启动子的控制下,制备了转基因矮牵牛花RNA干扰(RNAi)系,以降低PhABCG1的表达。三个独立系PhABCG1转录水平降低了70-80%(图1A),VOC总排放量减少了52-62%(图1B),同时内部VOC总库增加了101-157%(图1B)。在PhABCG1-RNAi花中,每个个体VOC的排放量都有不同程度的减少,其对应的内部库增加。转基因花的醇苷含量约为野生型花的2.5倍,占总VOC池的13%。
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图1.VOC释放变化情况
2.PhABCG1运输活性验证:PhABCG1转运苯丙类和苯类化合物
();() 作者首先在烟草亮黄2(BY-2)悬浮细胞中表达了his-strepii标记的PhABCG1。在50个筛选的转化子中,大多数转化子给出了接近预期分子质量(75.2kDa)的阳性信号。作为一个半大小的ABC转运体,PhABCG1具有单一膜结构域和单一核苷酸结合结构域,可以作为同源或异源二聚体发挥作用。由于没有其他半大小的ABCG基因在花中像PhABCG1那样上调,因此假设PhABCG1作为同二聚体起作用。当进行色谱时,PhABCG1在158kDa标记物前洗脱,与洗涤剂胶束(~70kDa)中预测的同型二聚体尺寸(2×75.2kDa)一致。
其次作者选择了苯甲酯和苯甲醇作为底物(矮牵牛花释放的主要VOC成分)。在用14c标记的底物孵育表达PhABCG1的对照和转基因BY-2系时,测量细胞相关的放射性,对应于被动扩散进入细胞和主动运输出细胞之间的差异。与对照细胞相比,在转基因BY-2细胞中观察到的细胞相关放射性降低,这表明PhABCG1将甲酸酯和苯甲醇运输出细胞(图2,A和C)。另外两个转基因BY-2细胞系也显示出类似的结果(图2C)。表达BY-2抗体的细胞系SC6(26)作为阴性对照,表现与野生型细胞相似。钒酸盐是一种已知的ABC转运蛋白抑制剂,在表达PhABCG1的BY-2细胞系中,苯甲酸甲酯的保留量增加了51%,证实了转运的活性(图2B)。用标记的单萜薄荷醇和二萜核醇类似物[3h-十氢-2-羟基-2,5,5,8a-四甲基-1-萘乙醇,烟草NtPDR1转运体的底物进行转运试验显示,表达PhABCG1的细胞和野生型BY-2细胞之间没有差异(图2C)。这一结果表明PhABCG1转运苯丙类和苯类化合物。
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图2.PhABCG1运输活性验证
3.其他ABCG转运体候选者筛选:未筛选到功能基因
在RNA-seq数据集中确定了16个额外的ABCG转运体候选者。在植入后的第2天,所有候选基因的转录水平都低于PhABCG1,只有两个候选基因(Ph4681和Ph5139)在第2天比第1天上调。Ph4681的表达量为PhABCG1的0.5%,而Ph5139的表达量为PhABCG1的17%。然而,短暂的RNAi下调Ph5139对VOC排放或内部池没有影响。
通过RNA-seq鉴定的所有矮牵牛花ABCG转运蛋白和已知功能的半大小拟南芥转运蛋白的系统发育分析显示,PhABCG1具有一个与矮牵牛花密切相关的蛋白Ph19708(65%氨基酸同源),没有拟南芥同源物。Ph19708的表达量是PhABCG1的0.2%,表明它对VOC排放的贡献很小,如果有的话。另外两个PhABCG1同源物(Ph13519和Ph9795,与PhABCG1共享约45%的氨基酸同源性)与已知的三个拟南芥ABCG转运蛋白(AtABCG11,AtABCG12和AtABCG13)聚集,并与PhABCG1和Ph19708单独聚集。
4.模型预测验证:累积的VOCs对膜完整性有不利影响
为了验证预测的模型,累积的VOCs对膜完整性有不利影响,作者用两种具有不同作用模式的化合物对2日龄野生型和PhABCG1-RNAi花的牵牛花花瓣进行了染色。第一种是碘化丙啶,只有在质膜被破坏时才扩散到细胞中并染色核酸。第二种是双醋酸荧光素,它穿过完整的细胞膜并保持无色,直到醋酸部分被细胞内酯酶除去。去乙酰化的荧光素是荧光的,不能穿过完整的细胞膜。
结果发现在PhABCG1-RNAi花瓣中,碘化丙啶染色细胞核,与累积的VOCs对质膜的损伤一致(图3A)。与这种效果类似,野生型花在喂食高浓度(15至30mM)苯甲醛时也表现出类似的染色。PhABCG1-RNAi花瓣中荧光素染色较少(图3B),为细胞膜破坏提供了独立的证据。与对照相比,PhABCG1-RNAi系的花更小,鲜重也更轻。然而,转基因和野生型花瓣表皮锥形细胞的扫描电镜显示,细胞基部直径和细胞形状没有差异。这表明这些细胞的分化和扩张发生在VOC积累之前,因此不受影响。
PhABCG1下调对矮牵牛花细胞膜完整性的影响
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